包括干細胞在內的細胞**產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場(chǎng)包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應用。
為了使細胞**產(chǎn)品成功應用，細胞的長(cháng)期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點(diǎn)，因為低溫保存是長(cháng)期保存細胞活力和生化功能的**可用方法。為了避免細胞內結冰對細胞結構的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經(jīng)上市。*常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。
然而，胎牛血清含有異種動(dòng)物源蛋白，可能會(huì )引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細胞毒性。據報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時(shí)間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類(lèi)型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應的報道。此外，已知DMSO會(huì )通過(guò)調節三種DNA甲基轉移酶(Dnmts)的轉錄水平和改變全基因組甲基化譜來(lái)影響小鼠胚狀體的表觀(guān)基因組，進(jìn)而導致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。
海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在wan全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動(dòng)物和線(xiàn)蟲(chóng)。哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實(shí)是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應有關(guān)，也與細胞膜磷脂和不穩定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質(zhì)干細胞，脂肪來(lái)源干細胞，人類(lèi)胚胎干細胞(hESCs) 和人類(lèi)誘導多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類(lèi)型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類(lèi)移植表肝細胞和人類(lèi)胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應用的主要障礙是其難以進(jìn)入細胞內部。以前已經(jīng)應用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來(lái)幫助海藻糖進(jìn)入細胞內部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時(shí)，且可能導致**的細胞損傷。
該研究探究了在沒(méi)有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類(lèi)型的多能干細胞系并復蘇，對幾個(gè)關(guān)鍵參數進(jìn)行了**研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩定性、內質(zhì)網(wǎng)(ER)穩態(tài)、DNA損傷反應等，以衡量不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。
1. 不同冷凍保護劑組成
組別 | 成分 |
A | 0.5M 海藻糖 |
B | 0.5M 海藻糖+2.5% 乙二醇 |
C | 0.5M 海藻糖+10% 乙二醇 |
D | 0.5M 海藻糖+10% 甘油 |
所有冷凍保護劑均現用現配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實(shí)驗中用到的細胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類(lèi)多能干細胞(hPSCs)的冷凍保護劑。
2. 細胞的冷凍保存及解凍
細胞在特定條件下培養，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進(jìn)行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過(guò)夜后，轉移到- 80°C冰箱。再24小時(shí)后，將低溫小瓶轉移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時(shí)，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以zhi定的接種量將其接種到適合每種細胞類(lèi)型的包被培養容器上。
3. 結果與討論
①細胞活力
解凍48?h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時(shí)的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復蘇后的活力并與對照組進(jìn)行比對。結果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類(lèi)型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見(jiàn)上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進(jìn)行冷凍保存及復蘇，進(jìn)行細胞冷凍復蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進(jìn)行比較。
當細胞*用海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時(shí)，解凍后的細胞恢復率降低，不同干細胞類(lèi)型的細胞恢復率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎的培養基中添加10% 乙二醇或甘油時(shí)(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優(yōu)于乙二醇。
此外，對比*由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實(shí)驗結果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結果。
這些結果表明，海藻糖可以有效地用于人類(lèi)多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可**提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過(guò)早分化的風(fēng)險。
②細胞形態(tài)
干細胞凍存另一個(gè)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過(guò)程可能在細胞內外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進(jìn)而誘導染色體異常分離，導致細胞生長(cháng)特征和形態(tài)變化。因此，可通過(guò)觀(guān)察凍存復蘇后的細胞形態(tài)來(lái)較為直觀(guān)地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時(shí)后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態(tài)。相位對比圖像證實(shí)，在所有細胞系中，海藻糖復合冷凍保護劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細胞形態(tài)與CS10中保存的細胞相同。
③標志物表達水平
為了確認凍存復蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過(guò)定量RT-PCR分析幾個(gè)標記物的表達水平。
對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。
對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進(jìn)行比對。結果顯示干細胞分化潛能未受影響。
④染色體穩定性
為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩定性的影響，對所有三種干細胞系進(jìn)行常規核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結果。
總體而言核型保持穩定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過(guò)程中隨機產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀(guān)察到克隆非整倍體或結構染色體畸變。
⑤內質(zhì)網(wǎng)應激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會(huì )對多能細胞響應內質(zhì)網(wǎng)應激和**UPR通路的能力產(chǎn)生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩態(tài)，ER整合了各種分子和細胞信號。內質(zhì)網(wǎng)應激和UPR都介導影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。
總體而言，與對照組CS10相比，內質(zhì)網(wǎng)應激/UPR反應水平適中。**一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實(shí)驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會(huì )明顯改變多能干細胞內質(zhì)網(wǎng)（ER）穩態(tài)。
海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）
1、產(chǎn)品名：海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）
2、中文名稱(chēng)：D(+)-海藻糖二水合物
3、英文名稱(chēng)：D(+)-Trehalose dihydrate (for injection)
4、化學(xué)名稱(chēng)：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物
5、型號：Hipo-S
6、含量測定：99.3%
7、CAS號：6138-23-4
8、EINECS登錄號：202-739-6
9、備案登記號：F20190000452
10、DMF號：034401
11、質(zhì)量標準：符合各國藥典標準（Chp,USP,JP,EP）
12、分子式：C12H22O11·2H2O
13、分子量：378.33
14、性狀：白色結晶性粉末
15、比旋度：+198.8°
16、酸度:6.0
17、氯化物:符合規定
18、硫酸鹽:符合規定
19、可溶性淀粉:符合規定
20、熾灼殘渣:0.04%
21、重金屬:符合規定
22、水分:9.5%
23、有關(guān)物質(zhì):總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出
24、無(wú)菌：符合規定
25、微生物限度：無(wú)菌
26、細菌內：<0.1IU/g
27、氮：符合規定
28、含量測定：99.3%
29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**
30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運輸。
31、貨號：008001
32、結構式：
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