海藻糖在細胞凍存方面的應用（3）小鼠睪丸生精細胞凍存

前兩期，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）和脂肪來(lái)源干細胞凍存的相關(guān)研究，發(fā)現向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復合型凍存保護劑，可以提升干細胞長(cháng)期凍存后的復蘇活率，從而有助于后續將干細胞用于疾病治療或創(chuàng )面修復等臨床應用。

本期，我們以小鼠睪丸生精細胞凍存為例，來(lái)探究一下海藻糖在輔助生殖領(lǐng)域的應用前景。

不同凍存保護劑對未性成熟小鼠睪丸生精細胞凍存的影響

近些年，隨著(zhù)輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的患者生育后代成為了可能。在此過(guò)程中，生殖相關(guān)細胞的長(cháng)期凍存成為了影響成功率的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)之一。

例如，對于青春期前男性腫瘤患者，性腺毒性治療可能會(huì )導致生育能力喪失，睪丸組織或細胞低溫長(cháng)期凍存是保存其生育力的重要手段。

然而對于全身性腫瘤患者，睪丸組織冷凍及復蘇后自體移植會(huì )帶來(lái)再次引入癌細胞的風(fēng)險?？紤]到睪丸細胞懸浮液可以進(jìn)行分選清除癌細胞，而精原干細胞（SSC）可以在體外培養，誘導分化成圓形精子細胞，通過(guò)圓形精子細胞注射獲得后代。

因此，對于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細胞的長(cháng)期凍存是保存生育能力的重要途徑之一，具有潛在的臨床應用價(jià)值。

來(lái)自鄭州大學(xué)人民醫院的張嘯龍等研究人員，采用兩周齡小鼠模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發(fā)育狀態(tài)，采用不同凍存方案對小鼠睪丸生精細胞進(jìn)行低溫凍存，探究最佳冷凍方案。

該研究根據凍存液組分不同，分為以下5組：

組別

采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細胞懸液，分裝，分別加入5組凍存保護劑并轉移至凍存管中。將凍存管進(jìn)行程序化冷凍，2個(gè)月后從液氮中取出，復蘇，檢測細胞活率、凋亡率、線(xiàn)粒體膜電位等。

①凍存前后細胞活率及復蘇率

與凍存前比較，5組實(shí)驗組細胞凍存復蘇后活率均有所下降。其中E組細胞活率及復蘇率顯著(zhù)高于其余4組。

②凍存后細胞恢復情況

以每組4mg睪丸組織解離凍存后實(shí)際回收的活細胞數，對睪丸細胞凍存復蘇后進(jìn)行定量計算。結果顯示E組細胞恢復數量顯著(zhù)高于其他4組。

③細胞凋亡率

流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。結果顯示，與對照組相比，各實(shí)驗組細胞凋亡率均顯著(zhù)增加。5組實(shí)驗組中，E組細胞凋亡率顯著(zhù)低于其余4組。

④線(xiàn)粒體膜電位

與對照組相比，凍存復蘇后5組實(shí)驗組細胞線(xiàn)粒體膜電位均顯著(zhù)下降，其中E組下降程度低，顯著(zhù)低于其余4組。

冷凍保護劑可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑，非滲透性保護劑中，常用的是蔗糖和海藻糖。此前有研究顯示，向冷凍保護劑中添加蔗糖或海藻糖，可顯著(zhù)提高恒河猴或小鼠的睪丸細胞復蘇活率。

該研究結果顯示，冷凍保護劑中添加0.1mol/L蔗糖或0.1mol/L海藻糖對細胞低溫冷凍均具有一定的保護作用，而同時(shí)添加0.1mol/L蔗糖和0.1mol/L海藻糖可顯著(zhù)提高小鼠睪丸生精細胞冷凍復蘇后的活率，降低細胞凋亡率，并降低低溫凍存對細胞線(xiàn)粒體膜電位的損傷。

但較高的DMSO濃度（15%）產(chǎn)生的細胞毒性會(huì )部分抵消蔗糖和海藻糖的冷凍保護作用。