AVT為大家帶來(lái)幾款新型注射級陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，包括DMG-PEG2000，DOTMA等，本期A(yíng)VT小編給大家分享一下DOTMA和DOPE在脂質(zhì)體轉染實(shí)驗中的應用，好奇的小伙伴速來(lái)圍觀(guān)！
脂質(zhì)體轉染實(shí)驗步驟
脂質(zhì)體(LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進(jìn)行轉染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時(shí)間等，對每批LR都要做，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h,開(kāi)始按這兩個(gè)參數繪出相應LR需用量的曲線(xiàn)，再選用LR和DNA兩者佳的劑量，確定出轉染時(shí)間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時(shí)間以不超過(guò)24h為宜。
細胞種類(lèi)：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
1、操作步驟(方法一)
1）取6孔培養板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個(gè)細胞的培養基，37℃、18%C02培養基40%-60%匯合時(shí)。
2)轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個(gè)空細胞所用的A液：用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會(huì )岀現微濁現象，但并不妨礙轉染
3)轉染準備：用2m1不含血清培養基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養基
4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無(wú)血清轉染液，換入正常培養基繼續培養
5)其余處理：如觀(guān)察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意：轉染時(shí)切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉染法操作步驟(方法二)
●……將細胞以5x105個(gè)/孔接種于6孔板中培養24h,使其達到50%-60%板底面積。
●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復合物
a、在1m1無(wú)血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉。
c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質(zhì)體上。
●……棄去細胞中的舊液，用1m1無(wú)血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復合物，37℃培養3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續培養14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定
3、穩定的脂質(zhì)體轉染法
●……接種細胞同前述，細胞長(cháng)至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養48h。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養基稀釋細胞，使細胞生長(cháng)一定時(shí)間篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進(jìn)行。
細胞轉染技術(shù)總述
一、細胞轉染途徑
轉染大致可分為物理介導、化學(xué)介導和生物介導三類(lèi)途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導技術(shù)；化學(xué)介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀；
脂質(zhì)體轉染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導的技術(shù)；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉染，和現在比較多見(jiàn)的各種病毒介導的轉染技術(shù)
1、物理介導
1）電穿孔法：靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞
優(yōu)點(diǎn)：轉染效率較高
缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對細胞的損傷較大，每次轉染需要
更多的細胞和DNA;每種細胞電轉的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化
2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內，使之整合入受體細胞基因組中
優(yōu)點(diǎn)：轉染效率高，可用于瞬時(shí)轉染和穩定轉染
缺點(diǎn)：導入DNA時(shí)需要一個(gè)細胞一個(gè)細胞注射，不適合大量轉染
3)基因槍?zhuān)阂蕾?lài)攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內2、化學(xué)介導
2、化學(xué)介導
(1)磷酸鈣共沉淀法
磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細胞表面結合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內吞作用進(jìn)入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉染的成功至關(guān)重要。
優(yōu)點(diǎn):能用于任何DNA導入哺乳類(lèi)動(dòng)物，瞬時(shí)轉染和穩定轉染。
缺點(diǎn):轉染效率低:進(jìn)入細胞的DNA只有1 %- 5 %可以進(jìn)入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進(jìn)行穩定表達。重復性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時(shí)間、細胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產(chǎn)生影響。
(2)脂質(zhì)體轉染法
中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA 并沒(méi)有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的 DNA自動(dòng)結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過(guò)內吞被導入細胞。
優(yōu)點(diǎn):適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞，可用于瞬時(shí)轉染和穩定轉染;轉染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉染到各種細胞，轉染的穩定性好，可重復性高，轉染時(shí)好不加血清和抗生素。
缺點(diǎn):陽(yáng)離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會(huì )干擾細胞的代謝。
(3)多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導
DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過(guò)內吞噬作用而使DNA轉導進(jìn)入細胞核，此法只適合暫時(shí)轉染實(shí)驗，轉染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(cháng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(cháng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30 分鐘-1.5小時(shí)),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(cháng)時(shí)間(8小時(shí))。
3、生物介導
病毒介導的轉染:以病毒作為載體,通過(guò)病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中，其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統很是常用。
優(yōu)點(diǎn):整和效率高，可使外源基因在宿主細胞中長(cháng)期表達，適用于難以轉染的原代細胞。
缺點(diǎn):存在潛在的安全危險性。
二、理想的細胞轉染方法
理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小、重復性好、安全、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導的轉染技術(shù)，是目前轉染效率zui高的方法，同時(shí)具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類(lèi)型有很強的選擇性，在一般實(shí)驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導的轉染方法，則各有其特點(diǎn)。
三、細胞轉染分類(lèi)
瞬時(shí)轉染:是指外源基因進(jìn)入受體細胞后，存在于游離的載體.上，不整合到細胞的染色體上。
穩定轉染: DNA 整合到宿主細胞的染色體中。
四、報告基因
是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個(gè)其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進(jìn)行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來(lái)標定目的基因的表達調控。
常用的報告基因系統:半乳糖苷酶報告系統、素酶報告系統、蛋白報告系統(GFP)等。
五、轉染方法
實(shí)驗用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。
1、轉染前1天將0.5~2X105細胞接種于24孔培養板，并加入500ul不含抗生素的*培養基，以保證轉染時(shí)細胞匯合達90~95%。
2、準備復合物
(1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無(wú)血清無(wú)抗生素的培養液中輕輕渾勻。
(2)將 2ul Lipofectamine2000稀釋于50u1無(wú)血清無(wú)抗生素的培養液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意:必須在25分內進(jìn)行。
(3) 5 分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3、吸去培養板的培養基，用PBS或無(wú)血清培養基清洗細胞2次。
4、將復合物(總體積100u1)加入培養孔，前后搖動(dòng)培養板使其分布均勻。
5、將細胞放入培養箱孵育4~6h后，可以更換含血清培養液去除復合物(也可不用)。
6、24~ 48h后可以觀(guān)察轉入基因表達情況。
7、穩定轉染:換含血清培養基24h后將細胞以1: 10 (或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養基篩選。
8、優(yōu)化:要保證細胞匯合率達90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5，一般細胞1: 2~3。
