疫苗的mRNA遞送系統性能的決定性因素
mRNA遞送系統的性能決定因素是多因素且相互作用的，包括：(1)它們向靶細胞遞送的能力，并將mRNA有效地釋放至細胞質(zhì)并進(jìn)行翻譯的效率；(2)佐劑，可以增強免疫反應；(3)將注射部位或全身分布的過(guò)度炎癥和脫靶表達可能引起的不良反應或毒性降至低。
劑量
目前在SARS-CoV-2臨床試驗中追求的大劑量范圍給藥（從1 µg到100 µg），能夠評價(jià)mRNA遞送系統的效率(表1)。臨床試驗中的劑量主要分為較高劑量（30-100 µg）的核苷修飾RNA(Moderna，BioNTech)，較低劑量（7.5-20 µg）的未修飾的RNA(CureVac，Translate Bio)，甚至更低劑量（1-10 µg）的自擴增RNA(Arcturus，倫敦帝國理工學(xué)院)。
決定這些劑量的因素有兩個(gè)：與恢復期血漿相比，中和抗體效價(jià)和T細胞反應水平，以及在每個(gè)劑量下發(fā)生不良反應的頻率和嚴重程度。第一階段臨床試驗中所有高劑量實(shí)驗的中止就證明了SARS-CoV-2疫苗有一個(gè)相當狹窄的接受窗口，達到保護所需的劑量產(chǎn)生了難以接受的不良反應的頻率和嚴重程度。在BioNTech第一階段臨床試驗中測試的兩種核苷修飾的RNA與恢復期血漿相比，具有較高的中和效價(jià)，而由于編碼膜結合的全長(cháng)刺突蛋白的較大結構RNA發(fā)生不良反應的頻率和嚴重程度較低，因此進(jìn)行了第三階段臨床研究。值得注意的是，劑量以質(zhì)量表示，而摩爾劑量取決于結構的長(cháng)度，而且，根據遞送系統的效率和靶向特性，實(shí)際翻譯的mRNA量只是兩者中的一小部分。
在預防傳染病的mRNA疫苗的動(dòng)物研究中，當使用魚(yú)精蛋白、樹(shù)枝狀大分子和早期陽(yáng)離子脂質(zhì)系統時(shí)，在小鼠中能夠產(chǎn)生中和抗體或抵御病毒的初始劑量高達10-80 µg(表3)。當之后使用*近的LNPs遞送的mRNA疫苗時(shí)，小鼠中和所需的劑量在給藥兩次時(shí)降低到接近1 µg，而對于未修飾的mRNA，所需劑量更低，接近0.25 µg。對于自我擴增的mRNA，劑量可以更低，只需要兩次給藥0.1 µg或一次給藥2 µg。在較大的動(dòng)物模型(倉鼠、雪貂和非人的靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物)中，可用的研究較少，劑量范圍很廣，從5 µg到200 µg，沒(méi)有明顯的模式。
有趣的是，當使用體表面積將人的劑量轉換為動(dòng)物的劑量時(shí)，60 kg人的100 µg劑量相當于3 kg獼猴的15 µg劑量和20 g小鼠的0.4 µg劑量，這兩個(gè)數據與表1和表3中的LNPs大致相同。顯然，給藥系統在確定有效劑量方面起著(zhù)重要作用。人們強烈希望提高給藥效率，以減少劑量和維持效價(jià)，因為這有望通過(guò)減少mRNA和給藥載體的局部反應和脫靶效應來(lái)降低不良反應的頻率和嚴重程度。減少劑量還將降低每個(gè)人接種疫苗所需的原材料數量和相關(guān)成本。特別是當前的大流行使人們關(guān)注到mRNA LNP疫苗的一些重大供應鏈和生產(chǎn)能力的限制，這一狀況可以通過(guò)更有效的遞送系統加以改善。
表3：體內預防性接種的mRNA劑量。不同的mRNA傳遞系統和不同的物種顯示了誘導中和抗體效價(jià)或抵御病毒攻擊所需的mRNA的劑量。與早期的遞送系統相比，脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)遞送的mRNA的所需劑量減少了10倍。
效價(jià)和遞送效率
已經(jīng)有許多研究試圖確定LNP和其他核酸遞送系統的結構-功能的關(guān)系。決定其效價(jià)或傳遞效率的LNP*常用的參數是pKa。pKa是使LNP中50%的可電離脂質(zhì)質(zhì)子化時(shí)的pH。到目前為止，LNP的pKa通過(guò)一種叫TNS的染料來(lái)測定，TNS是帶負電荷的，當與帶正電荷的LNP結合時(shí)，產(chǎn)生熒光增效果好果。
用TNS培養的LNPs在pH范圍較大的緩沖液內進(jìn)行熒光測量，以推斷染料與表面電荷的結合，估算pKa，發(fā)現達到了大熒光的一半?；贛C3的Onpattro LNP在靜脈注射后使肝細胞沉默的佳pKa為6.4。TNS的pKa在6.2-6.8范圍內對任何一種LNP都有一個(gè)肝細胞沉默的佳值。解釋這種依賴(lài)于pKa的原理是基于LNP的可電離脂質(zhì)在pH為7.4時(shí)接近中性，而在它進(jìn)入細胞后，內涵體的pH值隨著(zhù)內涵體途徑的演變而開(kāi)始下降，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，而可電離脂質(zhì)又將結合到內涵體的一個(gè)陰離子內源性磷脂上并且破壞其雙層結構，從而將mRNA釋放到細胞質(zhì)中用于核糖體翻譯表達蛋白。
內涵體逃逸需要可電離脂質(zhì)的另一個(gè)特征，即錐形的形態(tài)，其中脂質(zhì)尾部的橫截面大于其頭部。這使得可電離的脂質(zhì)/內涵體磷脂離子對和雙層結構不相容，并且更有可能形成倒六邊形的結構，從而破壞內涵體的膜結構。這也被稱(chēng)為分子形狀假說(shuō)，它解釋了為什么在飽和的C18烷基鏈上引入一個(gè)或兩個(gè)雙鍵會(huì )產(chǎn)生更多的錐形和更少的圓柱形的形態(tài)，即膜的破壞和內涵體逃逸。
這兩個(gè)C18亞油酸的尾部，與二甲胺頭部的適當的、調節好的pKa結合，是MC3可電離脂質(zhì)所定義的特征。取代MC3用于mRNA傳遞的可電離脂質(zhì)保留了pKa的要求，但通過(guò)在烷基尾部引入更多的支鏈來(lái)追求更大的內涵體裂解特性。例如，來(lái)自Moderna的脂質(zhì)H和脂質(zhì)5和Arcturus的脂質(zhì)2，2(8，8)4C CH3一樣，有三個(gè)烷基尾部，而Acuitas的ALC-0315有四個(gè)烷基尾部，A9有五個(gè)烷基尾部(表2)。這種增強的錐形形態(tài)解釋了含有這些可電離脂質(zhì)的LNPs是更有效的遞送載體，具有更強的內涵體逃逸。
雖然LNP的pKa和分子形狀假說(shuō)對LNP的遞送效率有很好的貢獻，但其他因素也很重要，如LNP表面PEG-脂質(zhì)的穩定性，以及四種脂質(zhì)在乙醇溶液中的比例，這些因素*終決定了LNP的超微結構。如上所述，PEG-脂質(zhì)通過(guò)提供親水性外殼來(lái)控制LNP的大小，該外殼在組裝過(guò)程中限制囊泡融合，從而使較高的PEG-脂質(zhì)濃度產(chǎn)生較小的LNP。
如一項研究表明，將PEG-脂質(zhì)的摩爾分數從0.25%改變到5%，可以將LNP的大小從117 nm減少到25 nm，而當使用摩爾分數為2.5%的PEG-脂質(zhì)時(shí)，肝細胞沉默的佳粒徑大小是78 nm。由于PEG-脂質(zhì)的烷基尾部有14個(gè)碳，它不能穩定地固定在LNP表面，隨著(zhù)可電離脂質(zhì)MC3和DSPC的脫落，它逐漸在循環(huán)中從LNP上脫落。這種PEG脫落被認為在一定程度上使LNP轉染有效，但如果脫落過(guò)強，會(huì )導致可電離脂質(zhì)和DSPC的迅速喪失，這將對內涵體逃逸產(chǎn)生不利的影響。
例如，通過(guò)將烷基尾部延伸到18個(gè)碳，PEG-脂質(zhì)不會(huì )脫落，但在肝細胞中也沒(méi)有被沉默。另一方面，加入較高濃度的PEG使顆粒變得更小，會(huì )導致更快的脫落、可電離脂質(zhì)丟失、并且減少沉默基因效果。目前，人們對LNP的不穩定和動(dòng)態(tài)性質(zhì)不*了解。另一項研究（與上面提到的研究類(lèi)似）還發(fā)現，用1.5%的PEG-脂質(zhì)制備的中等直徑64 nm的LNP比更大直徑（100 nm）的LNP(0.5%PEG脂質(zhì))以及更小直徑（48 nm）LNP(3%PEG脂質(zhì))能更有效地遞送mRNA。
然而，通過(guò)改變四種脂質(zhì)的摩爾比，在1.5%PEG-脂質(zhì)、直徑64 nm的LNP中，以保持計算出的LNP PEG層下的DSPC密度為佳值，這樣能夠制備更大尺寸的的（100 nm）LNP，其mRNA表達與64 nm的LNP相比增加了兩倍。因此，除了LNP的pKa、可電離脂質(zhì)的分子形狀和PEG-脂質(zhì)的動(dòng)力學(xué)之外，更詳細的LNP超微結構特征和每個(gè)組分的狀態(tài)也決定了其效價(jià)。
內涵體逃逸
對siRNA-LNPs的細胞攝取和內涵體轉運進(jìn)行了詳細的研究，并假設其與mRNA LNPs的細胞攝取和內涵體轉運相似。一項使用電子顯微鏡中金溶膠粒子計數的定量研究表明，對于MC3 LNP，內涵體中只有2%的siRNA從內涵體逃逸到胞漿中，導致每個(gè)細胞中有幾千個(gè)siRNA分子可供沉默。
然而，這個(gè)數字與在**相關(guān)濃度下每個(gè)細胞RISC與有功能活性的siRNA的相互作用估計水平的范圍相同。因此，絕大多數siRNA注定要進(jìn)行溶酶體降解或通過(guò)多囊體(晚期內涵體)循環(huán)在體外進(jìn)行釋放。增加LNPs的內涵體逃逸是提高給藥效率的主要途徑，主要是通過(guò)調節LNP的pKa和增加可電離脂質(zhì)的錐形形態(tài)來(lái)實(shí)現的。
對于后者，脂質(zhì)H和脂質(zhì)5含有三個(gè)分支，而在MC3中只有兩個(gè)分支，但具有相似的PKA，與MC3相比，它們的內涵體逃逸率變?yōu)樵瓉?lái)的四倍。目前還沒(méi)有報道Acuitas ALC-0315的內涵體逃逸情況，但Acuitas ALC-0315的肝細胞沉默效率是MC3的10倍，這表明其更具有錐形的四分支結構也有更強的內涵體逃逸。
因此，這些新一代的可電離脂質(zhì)似乎實(shí)現了內涵體逃逸率，與MC3 siRNA-LNPs的2-5%相比，接近15%或更高。這一領(lǐng)域的挑戰之一是缺乏可廣實(shí)施的可靠、標準化的內涵體逃逸方法。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多方法，但通常只針對一個(gè)實(shí)驗室組。*近還發(fā)現，mRNA發(fā)生胞吐的量與釋放到胞漿中的量相似。MC3 LNPs在MC3的晚期內涵體和NP1復合體中被解離，MC3LNPs和mRNA被重新包裹成外泌體，并從細胞中輸出。這些內-外泌體與*初的MC3 LNPs具有相似的mRNA遞送能力，但內-外泌體可以運輸到不同的組織，且似乎免疫**能力較低。LNPs攜帶的mRNA的外泌體重新分布的潛在意義仍有待探索。
電荷和配體介導的靶向
使用**帶電的陽(yáng)離子脂質(zhì)的早期脂質(zhì)納米顆粒很大，由于它們的**帶正電荷，很快就被**，并且他們通常是以肺部為靶點(diǎn)。BioNTech的研究小組減少了DOTMA/Dope mRNA LNPs中陽(yáng)離子DOTMA的數量，直到由于NP比小于1的陰離子mRNA過(guò)量而導致凈電荷帶負電。
靜脈注射這些帶負電荷的且長(cháng)度為300 nm的mRNA LNPs可以導致脾臟靶向和樹(shù)突狀細胞的mRNA表達，它們能夠介導適應性和I型干擾素介導的先天免疫機制用于**免疫**。同樣，用C12-200原型LNP生產(chǎn)脾靶向的mRNA LNP，但用小的、樹(shù)枝狀的可電離脂質(zhì)Cf-Deg-Lin代替C12-200，Cf-Deg-Lin具有四個(gè)亞油酸烷基鏈和四個(gè)氮原子，TNS pKa為5.7。LNP的這種極低的pKa將確?？呻婋x脂質(zhì)在pH低于7之前不被質(zhì)子化，從而制備出一種包載帶負電荷的mRNA的LNP，直到內涵體途徑晚期，并輸送到脾臟。
他們發(fā)現脾臟中表達mRNA的主要細胞群是B淋巴細胞，根據流式細胞術(shù)分析，其中7%的B淋巴細胞表達mRNA。*近，利用三種不同的堿性(MC3、C12-200或5A2-SC8)作為可電離脂質(zhì)，混合在一定摩爾分數的**性陽(yáng)離子脂質(zhì)(DOTAP)或**性陰離子脂質(zhì)(18PA)中，使LNPs具有凈正電荷、凈負電荷或凈中性電荷，從而實(shí)現了荷電靶向。與上述發(fā)現一致的是，高度正電的LNPs靶向肺部，高度負電的LNPs靶向脾臟，而中等電荷的LNPs主要靶向肝臟。肝靶向已被證明取決于A(yíng)po-E與近中性脂質(zhì)體或LNPs結合，負電荷的脂質(zhì)體這樣不會(huì )產(chǎn)**生這種情況。
脂質(zhì)納米顆粒的佐劑性
已知脂質(zhì)納米顆粒具有其自身的佐劑活性。一項研究顯示，與滅活病毒相比，對小鼠給藥10 µg和對非人的類(lèi)靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物給藥的100 µg的核苷修飾的編碼各種免疫原的mRNA LNPs(來(lái)自Acuitas)后，濾泡輔助T細胞(Tfh)和**中心B(GC B)細胞數量增加。Tfh細胞導致免疫球蛋白類(lèi)別的轉換、親和力成熟、以及分化生成長(cháng)期的記憶B細胞和漿細胞。當Fluc mRNA LNP與蛋白質(zhì)亞單位HA免疫原聯(lián)合使用時(shí)，發(fā)現LNP本身具有佐劑特性，**中心B細胞數量增加了4倍，盡管Tfh細胞數量與單獨使用蛋白質(zhì)相比并沒(méi)有增加。
因此LNP，特別是對核苷修飾的mRNA LNP似乎增強了GC B細胞的反應。另一項研究使用默克公司的不對稱(chēng)可電離脂質(zhì)，研究了LNP作為乙肝蛋白亞單位疫苗佐劑的使用。LNPs與蛋白質(zhì)亞單位疫苗聯(lián)合注射可將B細胞反應提高到與已知疫苗佐劑類(lèi)似的水平，包括鋁基佐劑、寡核苷酸和TLR4激動(dòng)劑3-O-脫脂單磷酰脂A(MPL)。LNP引起了強有效的的抗原特異性CD4+和CD8+T細胞反應，而在LNP中加入額外佐劑可能會(huì )進(jìn)一步影響Th1與Th2的偏向。該小組使用登革病毒免疫原進(jìn)行后續的研究發(fā)現，在LNP中也有類(lèi)似的強佐劑活性，而且這種活性依賴(lài)于可電離脂質(zhì)的存在。脂質(zhì)體中的脂質(zhì)成分以前也被認為在粘膜疫苗中具有佐劑活性。
結論
在過(guò)去的二十年里，mRNA**方法取得了非同尋常的進(jìn)展，首先是確定了利用修飾的核苷和序列工程控制mRNA先天免疫原性的方法，以及mRNA在疫苗和其他**適應癥中的應用。與以前的遞送系統相比，使用siRNA遞送的脂質(zhì)納米顆粒原型使遞送效率提高了一個(gè)數量級，并且仍在不斷提高，這主要是歸功于新型可電離脂質(zhì)的設計。mRNA LNP的結構、功能、效價(jià)、靶向性和生物學(xué)特性(如佐劑性)的許多方面仍有待探索，以便充分發(fā)揮這種強大的、具有變革意義的**方式的潛力。
