摘要：
當前mRNA脂質(zhì)納米粒(LNP)疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是它們必須在（超）di溫下儲存，了解這些疫苗不穩性的根本有助于我們合理提高mRNA-LNP產(chǎn)品的穩定性，從而降低對儲存溫度的要求。在這篇綜述中，我們討論了mRNA-LNP可能的內部結構、影響mRNA-LNP穩定性的因素以及優(yōu)化mRNA-LNP產(chǎn)品穩定性的策略。對mRNA-LNP結構的分析表明，mRNA、可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)和水存在于LNP中，中性輔助脂質(zhì)主要位于包裹的外壁。mRNA水解是mRNA-LNP不穩定的主要因素。目前尚不清楚LNP中的水如何與mRNA相互作用，以及mRNA的易降解位點(diǎn)通過(guò)與可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)的結合而受到多大程度地保護。為了提高mRNA-LNP疫苗的穩定性，首先，應優(yōu)化mRNA的核苷酸組成。其次，更好地了解mRNA在LNP中所處的環(huán)境可能有助于合理調整LNP結構以保持mRNA的完整性。此外，干燥技術(shù)如凍干，可能是仍有待探索的可行途徑。
1、背景介紹
當下正在開(kāi)發(fā)的許多疫苗中，有兩款疫苗已在預防感中顯示出高效保護率，這兩款疫苗代著(zhù)新一代疫苗產(chǎn)品：它們由脂質(zhì)納米粒包裹信使核糖核酸鏈（mRNA）。BioNTech/Pfizer和Moderna開(kāi)發(fā)的這些mRNA疫苗的保護效力約為95%，并且是*獲得FDA“緊急使用授權"和EMA “條件批準"的mRNA疫苗。疫苗mRNA編碼SARS-CoV-2病毒的刺突(S)糖蛋白，其中包括兩個(gè)脯氨酸替換（K986P和V987P突變），以穩定糖蛋白的融合前構象。在肌肉 (IM) 注射給藥后，LNP系統使宿主細胞能夠攝取并遞送mRNA 到細胞質(zhì)內，其中mRNA序列在核糖體中翻譯成S蛋白。在宿主細胞進(jìn)行翻譯后加工后，S蛋白在細胞表面以其融合前構象作為膜結合抗原被呈遞，為B細胞提供抗原靶標。此外，部分翻譯表達的S蛋白進(jìn)入抗原呈遞途徑，通過(guò)T細胞表位的組織相容性復合體（MHC）呈遞提供T細胞的抗原識別。EMA評估報告將mRNA疫苗在注射部位的作用機制認定如下：“注射LNP包裹的mRNA疫苗會(huì )導致短暫的局部炎癥，從而促使中性粒細胞和抗原呈遞細胞(APC)募集到注射部位，招募的APC能夠攝取 LNP納米粒繼而表達S蛋白，隨后可以遷移到發(fā)生T細胞的局部淋巴結"，由于這種固有的先天免疫，沒(méi)有必要用額外的佐劑配制mRNA疫苗。有趣的是，輝瑞/BioNTech和Moderna專(zhuān)門(mén)使用修飾后的核糖核苷酸來(lái)構建mRNA，以降低（而不是提高）mRNA固有的免疫原性，強調需要適當平衡mRNA疫苗的先天免疫活性（下文詳細討論）。體內抗原表達可以通過(guò)疫苗給藥后來(lái)實(shí)現，與mRNA疫苗的自佐劑特性相配合，終產(chǎn)生有效地中和抗體應答和細胞免疫，從而為疫苗接受者降低感的風(fēng)險。
與其他類(lèi)型的疫苗相比，mRNA疫苗有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗的一個(gè)普遍優(yōu)勢是它們的開(kāi)發(fā)相對較快，因為mRNA-LNP是一種平臺技術(shù)。在鑒定保護性蛋白抗原并對相應基因進(jìn)行測序后，可在數周內制備mRNA。由于編碼不同抗原的mRNA在化學(xué)和物理上高度相似，新mRNA疫苗的配方設計和制造過(guò)程遵循相同的步驟。與有復制缺陷的病毒型載體相比，mRNA疫苗可能有更高的病毒保護效力。與基于病毒載體的疫苗不同，機體不會(huì )對載體產(chǎn)生免疫反應。在這方面，mRNA疫苗類(lèi)似于基于脫氧核糖核酸(DNA)的疫苗。然而，DNA疫苗仍有極小的機會(huì )進(jìn)行潛在的基因組整合。此外，與mRNA疫苗相比，DNA疫苗在早期臨床試驗中顯示出相當低的免疫原性，這可能是因為基于DNA的疫苗需要進(jìn)入細胞核才能發(fā)揮作用，從而使有效遞送變得復雜?？傮w而言，靈活的設計、標準化的生產(chǎn)流程和相對較短的細胞質(zhì)存在時(shí)間使mRNA疫苗非常有優(yōu)勢，尤其是在病毒快速變異的大流行背景下。
然而，在開(kāi)發(fā) mRNA疫苗時(shí)遇到的挑戰之一是它們的穩定性差。目前，大多數mRNA疫苗是通過(guò)肌肉注射給藥的，在注射部位被宿主細胞攝取mRNA繼而表達出抗原。mRNA疫苗的早期研究表明，裸露的mRNA在給藥后會(huì )迅速降解。因此，在過(guò)去很多年，人們一直在努力改善體內給藥后mRNA的穩定性，一種方法是通過(guò)優(yōu)化mRNA結構的方法來(lái)減緩其降解。另一種成功且目前廣使用的方法是用LNP將mRNA包封，從而保護 LNP中的mRNA。這減少了給藥后mRNA過(guò)早的降解，并增強了向抗原呈遞細胞胞內遞送的能力。
盡管目前在提高mRNA-LNP疫苗的體內穩定性和功效方面取得了進(jìn)展，但對其儲存過(guò)程中的穩定性仍然關(guān)注較少。為了疫苗能有效地在全球范圍內進(jìn)行流通，mRNA-LNP疫苗能夠在冷藏溫度（2-8°C）或更高的溫度下有足夠長(cháng)的有效期。目前，公開(kāi)資料中幾乎沒(méi)有關(guān)于mRNA-LNP制劑長(cháng)期儲存穩定性數據。此外，尚不清楚在LNP中包封的mRNA會(huì )在多大程度上改善mRNA疫苗的儲存穩定性。關(guān)于LNP包封mRNA的結構和形態(tài)、LNP組分的化學(xué)穩定性和mRNA-LNP系統的膠體穩定性也知之甚少?，F在已知的是，為了更長(cháng)時(shí)間地儲存當前的mRNA疫苗，它們必須被冷凍。目前Moderna和BioNTech/輝瑞的疫苗分別需要在-15~-25℃和-60~-90℃儲存，但迄今為止，這兩家公司mRNA疫苗產(chǎn)品的降解過(guò)程和儲存溫度要求不同的原因尚不*清楚。
將mRNA-LNP需要冷凍儲存阻礙了疫苗的流通。尤其是，需要儲存在-60~-90 °C的極低溫，對疫苗在全球運輸、儲存和流通是個(gè)極大的挑戰。大多數其他疫苗可以在2–8 °C下儲存。顯然，當前迫切需要研發(fā)出性質(zhì)更加穩定不需要冷凍儲存的mRNA-LNP疫苗。本綜述概述了使mRNA疫苗更穩定的方法，以便它們可以在不太的溫度下儲存更長(cháng)時(shí)間。為了探討該主題，討論了mRNA-LNP疫苗的特性及其對儲存穩定性的影響，以確定mRNA疫苗不穩定的原因并探索提高其穩定性的方法。
