本篇文章AVT來(lái)介紹一下DOTMA在脂質(zhì)體轉染實(shí)驗中的實(shí)驗步驟。
脂質(zhì)體轉染實(shí)驗步驟
脂質(zhì)體(LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下方面的轉染方法之轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進(jìn)行轉染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時(shí)間等，對每批LR都要做，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h,開(kāi)始按這兩個(gè)參數繪出相應LR需用量的曲線(xiàn)，再選用LR和DNA兩者的劑量，確定出轉染時(shí)間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時(shí)間以不超過(guò)24h為宜。
細胞種類(lèi)：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
1、操作步驟(方法一)
1）取6孔培養板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個(gè)細胞的培養基，37℃、18%C02培養基40%-60%匯合時(shí)。
2)轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個(gè)空細胞所用的A液：用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會(huì )岀現微濁現象，但并不妨礙轉染
3)轉染準備：用2m1不含血清培養基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養基
4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無(wú)血清轉染液，換入正常培養基繼續培養
5)其余處理：如觀(guān)察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意：轉染時(shí)切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉染法操作步驟(方法二)
●……將細胞以5x105個(gè)/孔接種于6孔板中培養24h,使其達到50%-60%板底面積。
●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復合物
a、在1m1無(wú)血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉。
c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質(zhì)體上。
●……棄去細胞中的舊液，用1m1無(wú)血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復合物，37℃培養3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續培養14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定
3、穩定的脂質(zhì)體轉染法
●……接種細胞同前述，細胞長(cháng)至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養48h。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養基稀釋細胞，使細胞生長(cháng)一定時(shí)間篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進(jìn)行。
